Desarrollo del sistema DETECTR (CRISPR-Cas12a) para la detección del virus del dengue en aguas residuales
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Data
2026-02-13
Autores
Suazo, María Esther Vivanco
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Resumo
O vírus da dengue (DENV) constitui uma ameaça significativa à saúde pública. Seus quatro serotipos e a semelhança de sintomas com outras infecções virais complicam o diagnóstico e o controle da patologia. Neste contexto, a Epidemiologia Baseada em Águas Residuais (WBE) emerge como uma ferramenta promissora para o monitoramento do DENV, uma vez que permite observar a circulação em nível populacional sem a necessidade de exames individuais, contemplando a excreção de pacientes sintomáticos e assintomáticos. Todavia, a baixa concentração e a rápida degradação do RNA viral em amostras de esgoto exigem plataformas de detecção com sensibilidade superior ás metodologias convencionais. O objetivo deste projeto foi desenvolver um sistema de diagnóstico molecular baseado em DETECTR (CRISPR-Cas12a) para a detecção sensível e específica do RNA do DENV em amostras de águas residuais na cidade de Foz do Iguaçu, PR. Para tanto, foram delineados crRNAs específicos para DENV-2 e DENV-3, realizou-se a produção in vivo e a purificação da proteína AsCas12a, e comprovou-se a atividade catalítica do complexo ribonucleoproteico (RNP). Os resultados confirmaram a funcionalidade do sistema in vitro, embora tenham demonstrado uma forte dependência das condições do tampão de reação; foram desenvolvidas metodologias de extração de material genético viral de amostras de águas residuais para a posterior validação do sistema DETECTR; outrossim, foi projetado um complexo in vivo para a detecção múltipla do DENV. Conclui-se que o sistema DETECTR é uma ferramenta viável e sensível para a detecção do DENV em águas residuais, sendo necessárias otimizações nas condições de reação para mitigar a inibição da matriz e garantir a robustez da detecção.
Resumen
El virus del dengue (DENV) constituye una amenaza significativa para la salud pública. Sus cuatro serotipos y la similitud de síntomas con otras infecciones virales complica su diagnóstico y control. En este contexto, la Epidemiología Basada en Aguas Residuales (WBE) emerge como una herramienta prometedora para el monitoreo del DENV, ya que monitorea la circulación a nivel poblacional sin la necesidad de exámenes individuales y contempla la excreción tanto de pacientes sintomáticos como asintomáticos. Sin embargo, la baja concentración y la rápida degradación del RNA viral en las muestras de aguas residuales exigen plataformas de detección con una sensibilidad superior a las metodologías convencionales. El objetivo de este proyecto fue desarrollar un sistema de diagnóstico molecular basado en DETECTR (CRISPR-Cas12a) para la detección sensible y específica del RNA del DENV en muestras de aguas residuales en la ciudad de Foz do Iguaçu, PR. Para ello, se diseñaron crRNAs específicos para DENV-2 y DENV-3, se realizó la producción in vivo y la purificación de la proteína AsCas12a, y se comprobó la actividad catalítica del complejo ribonucleoproteico (RNP). Los resultados confirmaron la funcionalidad del sistema in vitro, aunque demostraron una fuerte dependencia de las condiciones del buffer de reacción; se desarrollaron metodologías de extracción de material genético viral de muestras de aguas residuales para la posterior validación del sistema DETECTR; así también, fue diseñado un complejo in vivo para la detección múltiple del DENV. Se concluye que el sistema DETECTR es una herramienta viable y sensible para la detección del DENV en aguas residuales, en la cual son necesarias optimizaciones en las condiciones de reacción para mitigar la inhibición de la matriz y garantizar la robustez de detección.
Abstract
The dengue virus (DENV) represents a significant threat to public health. The existence of four distinct serotypes, coupled with symptomatic similarities to other viral infections, complicates both diagnosis and disease control. In this context, Wastewater-Based Epidemiology (WBE) emerges as a promising tool for DENV surveillance, as it monitors population-level circulation without requiring individual testing, accounting for viral shedding from both symptomatic and asymptomatic individuals. However, the low concentration and rapid degradation of viral RNA in sewage samples necessitate detection platforms with sensitivity superior to conventional methodologies. The objective of this project was to develop a molecular diagnostic system based on DETECTR (CRISPRCas12a) for the sensitive and specific detection of DENV RNA in wastewater samples from Foz do Iguaçu, PR. To this end, specific crRNAs for DENV-2 and DENV-3 were designed; the in vivo production and purification of the AsCas12a protein were performed; and the catalytic activity of the ribonucleoprotein (RNP) complex was verified. The results confirmed the in vitro functionality of the system, albeit demonstrating a strong dependence on reaction buffer conditions. Furthermore, viral genetic material extraction methodologies from wastewater were developed for subsequent DETECTR validation, and an in vivo complex for multiplex DENV detection was designed. It is concluded that the DETECTR system is a viable and sensitive tool for DENV detection in wastewater, though optimizations in reaction conditions remain necessary to mitigate matrix inhibition and ensure detection robustness.
Descrição
Disertación de maestría presentada al Programa de Posgrado en Biociencias, del Instituto Latinoamericano de Ciencias de la Vida y de la Naturaleza, de la Universidad Federal de la Integración Latinoamericana, como requisito parcial a la obtención del título de Maestra en Ciencias.
Palavras-chave
vigilância sanitária, Epidemiologia, vírus da dengue, águas residuais
Citação
SUAZO, María Esther Vivanco. 2025. Desarrollo del sistema DETECTR (CRISPR-Cas12a) para la detección del virus del dengue en aguas residuales. Orientadores: ROJAS, Cristian Antonio (orientador). 63 h.. Disertación (Maestría) - PPG-BC (Programa de Posgrado en Biociencias), UNILA (Universidad Federal de la Integración Latinoamericana), Foz de Iguaçu.