Contribuição ao estudo da ação in vitro do veneno da aranha marrom, Loxosceles gaucho, sobre plaquetas humanas e de coelho. Participação das plaquetas na dermonecrose induzida experimentalmente pelo veneno loxoscélico em coelhos
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Data
2007-08
Autores
Tavares, Flávio Luiz
Título da Revista
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Título de Volume
Editor
Universidade de São Paulo, FMVZ
Resumo
Os venenos de aranhas do gênero Loxosceles possuem uma ampla gama de atividades em
diferentes células, tecidos e sistemas, e é notória a sua capacidade de causar a formação da lesão
dermonecrótica. Em um trabalho prévio, relatamos uma intensa trombocitopenia induzida pelo
veneno loxoscélico em coelhos. Objetivou-se no presente estudo avaliar primeiramente a
interação in vitro entre as plaquetas, humanas e de coelhos, com o veneno de Loxosceles gaucho
e seu principal componente, a fração esfingomielinásica. Posteriormente, investigou-se o papel da
plaqueta no desenvolvimento da lesão dermonecrótica através de um modelo de trombocitopenia
em coelhos. Nos estudos in vitro, os resultados de agregação em plasma rico em plaquetas
evidenciou que tanto o veneno total quanto a fração esfingomielinásica induziram um aumento
desta resposta nas plaquetas das duas espécies, que foi mais intensa nas plaquetas humanas. Uma
vez que em plaquetas lavadas a agregação não foi constatada, confirmou-se a necessidade de
componente(s) plasmático(s) para a indução desta resposta. Ainda, os dados de LDH indicaram
que o veneno total, nas concentrações aqui utilizadas, não foi capaz de causar à lise plaquetária.
Com relação à ativação, o veneno total, foi capaz de aumentar a expressão da LIBS1 nas
plaquetas de ambas as espécies e de P-selectina na plaqueta de coelho. Sob as nossas condições
experimentais, a fração não promoveu o aumento dos marcadores de ativação. Finalizando os
estudos in vitro, o veneno total e a fração provocaram um aumento da adesão nas plaquetas das
duas espécies, sendo que a resposta à fração esfingomielinásica mostrou-se dose-dependente. O
estudo experimental, por vez, necessitou de uma etapa preliminar para a obtenção de um
anticorpo anti-plaqueta, produzido em cabras, que mostrou-se eficaz em induzir um intenso
quadro trombocitopênico em coelhos. Análises histopatológicas indicam que a ausência das
plaquetas não diminuiu a formação de trombos intravasculares na área da derme sob a ação do
veneno. O desenvolvimento da lesão dermonecrótica em coelhos injetados com o veneno loxoscélico mostrou-se mais intenso naqueles depletados de plaquetas do que nos animais com
número normal de plaquetas, constatável pelo desenvolvimento de maiores áreas de equimose e
das escaras necróticas. Os resultados semelhantes dos níveis plasmáticos do fator de von
Willembrand, dos tempos de protrombina e de tromboplastina parcial ativada, assim como dos
testes de fagocitose por polimorfonucleares isolados do sangue periférico, entre os coelhos
trombocitopênicos e aqueles com contagem normal de plaquetas, evidenciam que não houve
alterações expressivas nas células endoteliais, no sistema da coagulação e na capacidade
fagocítica via C3b dos polimorfonucleares do sangue periférico. Os presentes resultados mostram
que o veneno loxoscélico in vitro é capaz de elicitar em plaquetas humanas e de coelhos as
respostas de agregação, de adesão e de ativação. Por fim, as diferenças no desenvolvimento da
lesão, constatadas entre o animal trombocitopênico e o animal normal, evidenciam que a plaqueta
é um fator importante para controlar a expansão e a gravidade da lesão dermonecrótica induzida
em coelhos pelo veneno loxoscélico.
Venoms from Loxosceles spiders exhibit a wide range of activities on different cells, tissues and systems, being specially evident their ability to cause a dermonecrotic lesion. In a previous paper, we showed that Loxosceles gaucho spider venom induces intense thrombocytopenia in rabbits. Thus, in the present study, we firstly aimed to evaluate the in vitro interaction between human and rabbits platelets and L. gaucho venom and its major component, the sphingomyelinase fraction. Secondly, we investigated the platelet role in the dermonecrotic lesion formation using an experimental model of thrombocytopenia in rabbits. Both total venom and its sphingomyelinase fraction stimulated in vitro aggregation per se in platelet-rich plasma from both species, but a more intense response was obtained with human platelets. Taking into consideration that neither total venom nor its sphingomyelinase fraction induced aggregation of washed platelets, it can be deduced that one or more plasma components are necessary to induce this response. Moreover, LDH data indicated that total venom, at least at the concentration levels used in this study, cannot induce platelet lysis. Regarding platelet activation, total venom was able to increase the expression of LIBS1 on both human and rabbit platelet surface and P-selectin on only rabbit platelet surface. However, the sphingomyelinase fraction did not increase the expression of any marker of platelet activation, at least in the experimental conditions used in this study. Another in vitro study showed that both total venom and its sphingomyelinase fraction induce an increase in human and rabbit platelet adhesion, with the sphingomyelinase fraction exhibiting a dose-dependent response. For the study using an animal model of thrombocytopenia, it was necessary to previously produce goat antibodies against rabbit platelets, which showed to be effective to induce an intense thrombocytopenia in rabbits. Histopathological analysis of venom-induced dermic tissue lesion indicated that platelet absence does not decrease the formation of intravascular thrombi in the injured area. Nonetheless, bigger areas of equimosis and necrotic scabs could be observed in the dermonecrotic lesion of rabbits injected with loxoscelic venom and depleted of platelets. In the different groups, plasma levels of von Willembrand factor, prothrombin and activated partial thromboplastin times, and data from phagocytosis tests using polymorphonuclear cells isolated from rabbit periferical blood were similar comparing thrombocitopenic rabbits with those exhibiting normal platelet count; therefore, we can deduce that there is not any expressive alteration in endotelial cells, coagulation system and phagocytic ability of polymorphonuclear leukocytes via their complement receptor C3b. In conclusion, the loxoscelic venom is able to unchain in vitro different mechanisms leading to adhesion, activation and aggregation of both human and rabbit platelets. Furthermore, due to differences in the dermic lesion patterns between thrombocitopenic and normal animals, we can conclude that platelets must play a key role in controlling the expansion and severity of the dermonecrotic lesion induced in rabbits by L. gaucho venom.
Venoms from Loxosceles spiders exhibit a wide range of activities on different cells, tissues and systems, being specially evident their ability to cause a dermonecrotic lesion. In a previous paper, we showed that Loxosceles gaucho spider venom induces intense thrombocytopenia in rabbits. Thus, in the present study, we firstly aimed to evaluate the in vitro interaction between human and rabbits platelets and L. gaucho venom and its major component, the sphingomyelinase fraction. Secondly, we investigated the platelet role in the dermonecrotic lesion formation using an experimental model of thrombocytopenia in rabbits. Both total venom and its sphingomyelinase fraction stimulated in vitro aggregation per se in platelet-rich plasma from both species, but a more intense response was obtained with human platelets. Taking into consideration that neither total venom nor its sphingomyelinase fraction induced aggregation of washed platelets, it can be deduced that one or more plasma components are necessary to induce this response. Moreover, LDH data indicated that total venom, at least at the concentration levels used in this study, cannot induce platelet lysis. Regarding platelet activation, total venom was able to increase the expression of LIBS1 on both human and rabbit platelet surface and P-selectin on only rabbit platelet surface. However, the sphingomyelinase fraction did not increase the expression of any marker of platelet activation, at least in the experimental conditions used in this study. Another in vitro study showed that both total venom and its sphingomyelinase fraction induce an increase in human and rabbit platelet adhesion, with the sphingomyelinase fraction exhibiting a dose-dependent response. For the study using an animal model of thrombocytopenia, it was necessary to previously produce goat antibodies against rabbit platelets, which showed to be effective to induce an intense thrombocytopenia in rabbits. Histopathological analysis of venom-induced dermic tissue lesion indicated that platelet absence does not decrease the formation of intravascular thrombi in the injured area. Nonetheless, bigger areas of equimosis and necrotic scabs could be observed in the dermonecrotic lesion of rabbits injected with loxoscelic venom and depleted of platelets. In the different groups, plasma levels of von Willembrand factor, prothrombin and activated partial thromboplastin times, and data from phagocytosis tests using polymorphonuclear cells isolated from rabbit periferical blood were similar comparing thrombocitopenic rabbits with those exhibiting normal platelet count; therefore, we can deduce that there is not any expressive alteration in endotelial cells, coagulation system and phagocytic ability of polymorphonuclear leukocytes via their complement receptor C3b. In conclusion, the loxoscelic venom is able to unchain in vitro different mechanisms leading to adhesion, activation and aggregation of both human and rabbit platelets. Furthermore, due to differences in the dermic lesion patterns between thrombocitopenic and normal animals, we can conclude that platelets must play a key role in controlling the expansion and severity of the dermonecrotic lesion induced in rabbits by L. gaucho venom.
Abstract
Descrição
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Patologia Experimental e Comparada da Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para a obtenção de Título
de Doutor em Ciências
Departamento:
Patologia
Área de Concentração:
Patologia Experimental e Comparada
Orientadora:
Dra. Ida Sigueko Sano-Martins
Palavras-chave
Loxosceles, Plaquetas - adesão, Agregação, Dermonecrose
Citação
TAVARES, F. L. Contribuição ao estudo da ação in vitro do veneno da aranha marrom, Loxosceles gaucho, sobre plaquetas humanas e de coelho. Participação das plaquetas na dermonecrose induzida experimentalmente em coelhos pelo veneno loxoscélico. 2007. 105 f. Tese (Doutorado
em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007