Do clássico à inovação em sexagem de aves: sustentabilidade no uso do PCR convencional para novos grupos e busca pela expressão de novo gene sexo-específico com potencial para imunosexagem.
Data
2024
Autores
Fabichaki, Sabrina Thais
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Resumo
O dimorfismo sexual consiste em diferenças morfológicas, fisiológicas ou comportamentais entre fêmeas e machos de indivíduos da mesma espécie. A distinção de indivíduos fêmeas e machos de aves é de extrema importância para diferentes setores da ecologia, ornitologia e conservação. Contudo, o dimorfismo sexual nem sempre é aparente a olho nu e, em algumas espécies de aves, pode ser inexistente. Atualmente, a metodologia mais utilizada para a sexagem no Brasil é através de técnica de PCR, utilizando Primers comerciais, seguida de corrida em gel de agarose. Apesar dessa técnica apresentar resultados positivos com custos relativamente baixos por amostra, é necessária uma equipe técnica especializada, equipamentos e reagentes onerosos. De maneira alternativa, a utilização de anticorpos monoclonais para imunossexagem já é realizada em algumas espécies de mamíferos. Com auxílio de um anticorpo monoclonal específico para o antígeno HY (exclusivo masculino) ligado a fatores de fluorescência, a distinção do cromossomo sexual de gametas pode ser realizada de forma rápida, segura e eficaz. Com a intenção de propor uma metodologia semelhante que pudesse ser utilizada na produção de um kit rápido de sexagem para aves, em trabalho anterior, realizamos um levantamento in silico de proteínas sexo-específica de aves (usando Gallus gallus) presentes na membrana celular de células sanguíneas. Utilizando ferramentas e plataformas de bioinformática, foi identificada uma proteína predita (que chamaremos provisoriamente de proteína SMEFC - "sex-specific marker expressed from the female chromosome”), ainda não caracterizada, proveniente do cromossomo W, com estrutura transmembranar e domínio extracelular preditos. Tal proteína apresenta baixa homologia com outras estruturas proteicas e uma boa conservação entre as espécies de aves. Diante desse cenário, no presente trabalho foi verificada a presença do mRNA da proteína SMEFC em amostras sanguíneas de galinhas, através da metodologia de PCR por transcriptase reversa (RT-PCR). Para isso, utilizaram-se pares de Primers específicos para a sequência de mRNA, desenhados previamente. Apesar de inúmeras tentativas e adaptações, os resultados levantados foram inconclusivos, visto que foi possível observar um anelamento inespecífico em indivíduos machos, impedindo a determinação, dessa forma, de que o mRNA da proteína SMEFC seria sexo-específico. Sendo assim, análises futuras com Primers mais específicos são necessárias. Concomitantemente, foi analisada a funcionalidade da sexagem comercial pelos Primers P0, P2 e P8, em comparação à metodologia mais usada que utiliza apenas o conjunto P2/P8. Foram testadas não somente espécies já sexadas pelo conjunto dos três iniciadores como seis novas espécies não testadas anteriormente, segundo a literatura. Por fim, buscando inovar e agir com sustentabilidade na ciência, foram utilizados kits de extração de DNA viral excedentes do período da Covid, adaptando à utilização na extração de DNA do canhão de penas das nove diferentes espécies sexadas com os Primers P0/P2/P8. O uso do conjunto dos três iniciadores mostrou um excelente desempenho na distinção visual em gel de agarose a 1,5 %, para diferentes espécies pertencentes a distintos grupos, ressaltando a confiabilidade nos resultados da sexagem e a conservação molecular da região CHD, amplificada.
Abstract
Sexual dimorphism consists of morphological, physiological or behavioral differences between female and male individuals of the same species. The distinction of female and male individuals of birds is extremely important for different areas of ecology, ornithology and conservation. However, sexual dimorphism is not always apparent to the naked eye and in some bird species, may be nonexistent. Currently, the most used method for sexing in Brazil is through the PCR technique, using sets of commercial primers, followed by an agarose gel electrophoresis. Although this technique provides positive results at a relatively low cost per sample, it requires a specialized technical team and expensive equipment and reagents. Alternatively, the use of monoclonal antibodies for immunosexing is already used in some mammalian species. With the help of a monoclonal antibody specific for the HY antigen (male exclusive) linked to fluorescence factors, the distinction of the sex chromosome of gametes can be achieved quickly, safely and effectively. With the intention of proposing a similar method that could be used in the production of a fast sexing kit for birds, in a previous work we carried out an in silico survey of bird sex-specific proteins (using Gallus gallus) present in the cell membrane of blood cells. Using bioinformatic tools and platforms, we identified a putative protein (which we will provisionally call SMEFC - “sex-specific marker expressed from the female chromosome”), a yet uncharacterized protein coded from the W chromosome, with a putative transmembrane structure and extracellular domain. This protein shows low homology with other proteic structures and good conservation between bird species. Considering this context, in the current study, we verified the presence of SMEFC protein mRNA in chicken blood samples using reverse transcriptase PCR (RT-PCR). To this end, we used pairs of specifics primers designed previously for the mRNA sequence. Despite numerous attempts and adjustments, the results were inconclusive, since non-specific annealing could be observed in male individuals, thus not confirming that the mRNA of the SMEFC protein was sex-specific. Future analyses with more specific primers must be performed. Concurrently, the functionality of commercial sexing using primers P0, P2 and P8 was analyzed, in comparison to the most used methodology that uses only the P2/P8 set. We tested not only species already sexed by the set of three initiators, but also six new species not previously tested, according to the literature. Finally, in attempt to innovate and act with sustainability in science, viral DNA extraction kits surplused from the Covid period were used adapting to the use on feather calamus DNA extraction from the nine different species sexed with the P0/P2/P8 primers. The use of the three primers set showed excellent performance in visual distinction on 1.5% agarose gel for different species belonging to different groups, highlighting the reliability of the sexing results and the molecular conservation of the amplified CHD region.
Descrição
Dissertação de mestrado apresentada ao PPG-BC (Programa de Pós-Graduação em Biociências), do ILACVN (Instituto Latino-Americano de Ciências da Vida e da Natureza), da UNILA (Universidade Federal da Integração Latino-Americana), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências.
Palavras-chave
aves, heterogamético, transcrito, preservação, galinha.
Citação
FABICHAKI, Sabrina Thais. 2024. Do clássico à inovação em sexagem de aves: sustentabilidade no uso do PCR convencional para novos grupos e busca pela expressão de novo gene sexo-específico com potencial para imunossexagem. Orientadora: GRADE, Carla Vermeulen Carvalho. 138 f. Dissertação (Mestrado) - PPG- BC (Programa de Pós-Graduação em Biociências), UNILA (Universidade Federal da Integração Latino-Americana), Foz do Iguaçu.