Análise comparativa entre um teste sorológico comercial ELISA-VETLISA/BIOCLIN(RK39) e um ensaio baseado em glutamina sintetase para diagnóstico da leishmaniose visceral canina

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dc.contributor.authorTorres, Sara
dc.date.accessioned2026-07-21T16:45:18Z
dc.date.available2026-07-21T16:45:18Z
dc.date.issued2026-07-21
dc.descriptionDissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduaçãoem Biociências, do Instituto Latino-Americano de Ciências da Vida e da Natureza, da Universidade Federal da Integração Latino-Americana, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências, área de concentração Biociências.
dc.description.abstractA leishmaniose visceral canina (LVC) é uma zoonose de grande relevância em saúde pública, amplamente distribuída em áreas endêmicas, cujo diagnóstico é desafiado pela diversidade de manifestações clínicas, pela complexidade da resposta imune dos cães infectados e pelas limitações associadas aos métodos diagnósticos disponíveis. A identificação precisa de animais infectados é fundamental para o manejo clínico e para as estratégias de vigilância e controle da doença. Este estudo realizou uma análise comparativa entre dois testes sorológicos utilizados no diagnóstico da LVC: o teste comercial ELISA-Vetlisa/BIOCLIN (rK39) e um ensaio experimental baseado na enzima glutamina sintetase (GS) de Leishmania infantum. Foram analisadas amostras séricas de cães provenientes de um laboratório parceiro, obtidas de animais submetidos à investigação diagnóstica para leishmaniose visceral canina e acompanhadas de informações clínicas compatíveis com a doença, incluindo perda de peso, alterações cutâneas, linfadenomegalia e manifestações oftalmológicas. No fluxo diagnóstico adotado, as amostras foram inicialmente avaliadas pelo teste imunocromatográfico rápido DPP® leishmaniose visceral canina (bio-manguinhos/fiocruz) como triagem sorológica. Posteriormente, as amostras foram analisadas pelo teste comercial ELISA-Vetlisa/BIOCLIN (rK39) e pelo ensaio experimental ELISA-GS. A detecção molecular por PCR foi realizada como método de referência para a identificação do DNA parasitário. O estudo avaliou o desempenho diagnóstico dos métodos por meio da análise de sensibilidade, especificidade, valores preditivos e curva ROC, considerando a complexidade da resposta imune e as limitações próprias das abordagens sorológicas e moleculares. A metodologia incluiu a padronização do ELISA-GS, a análise das absorbâncias, a identificação de concordâncias e discordâncias entre os métodos e a avaliação do impacto do rendimento e da qualidade da proteína recombinante expressa, fatores críticos para o desempenho de ensaios imunodiagnósticos baseados em antígenos recombinantes. Os resultados demonstraram que o teste comercial ELISA-Vetlisa/BIOCLIN (rK39) apresentou alta sensibilidade diagnóstica (100%) e especificidade de 90,3%, evidenciando elevada capacidade de detecção de anticorpos em amostras classificadas como positivas pela PCR. A presença de amostras soropositivas com PCR não detectável sugere persistência de anticorpos após exposição prévia ao parasita, variabilidade clínica entre os animais infectados e limitações da PCR quando aplicada a amostras com baixa carga parasitária, especialmente em sangue periférico. O ensaio ELISA-GS apresentou sensibilidade de 83,3% e especificidade de 100%, com ocorrência de dois falsos negativos e ausência de falsos positivos, indicando elevada capacidade de exclusão de animais não infectados, porém menor eficiência na detecção de todos os casos positivos quando comparado ao teste comercial. A análise das curvas ROC evidenciou maior capacidade discriminatória do teste comercial em relação ao ensaio experimental. A glutamina sintetase apresentou desempenho moderado como alvo para diagnóstico sorológico, possivelmente devido à sua natureza predominantemente intracelular e à limitada imunogenicidade humoral detectável. Os resultados reforçam a importância da interpretação integrada de métodos sorológicos e moleculares no diagnóstico da LVC e destacam a relevância do uso combinado de estratégias diagnósticas para aumentar a confiabilidade da detecção da infecção em cães provenientes de áreas endêmicas. Resumen La leishmaniasis visceral canina (LVC) es una zoonosis de gran relevancia para la salud pública, ampliamente distribuida en zonas endémicas, cuyo diagnóstico se ve dificultado por la diversidad de manifestaciones clínicas, la complejidad de la respuesta inmunitaria de los perros infectados y las limitaciones de los métodos diagnósticos disponibles. La identificación precisa de los animales infectados es fundamental para el manejo clínico y para las estrategias de vigilancia y control de la enfermedad. Este estudio realizó un análisis comparativo entre dos pruebas serológicas utilizadas en el diagnóstico de la LVC: la prueba comercial ELISA-Vetlisa/BIOCLIN (rK39) y un ensayo experimental basado en la enzima glutamina sintetasa (GS) de Leishmania infantum. Se analizaron muestras de suero de perros procedentes de un laboratorio colaborador; estas muestras se obtuvieron de animales sometidos a investigación diagnóstica de leishmaniasis visceral canina y presentaban información clínica compatible con la enfermedad, como pérdida de peso, alteraciones cutáneas, linfadenomegalia y manifestaciones oftalmológicas. En el flujo de trabajo diagnóstico adoptado, las muestras se evaluaron inicialmente mediante la prueba inmunocromatográfica rápida DPP® para leishmaniasis visceral canina (Bio-Manguinhos/Fiocruz) como prueba de cribado serológico. Posteriormente, las muestras se analizaron mediante la prueba ELISA-Vetlisa/BIOCLIN comercial (rK39) y el ensayo ELISA-GS experimental. La detección molecular por PCR se realizó como método de referencia para la identificación del ADN parasitario. El estudio evaluó el rendimiento diagnóstico de los métodos a través de la sensibilidad, la especificidad, los valores predictivos y el análisis de la curva ROC, considerando la complejidad de la respuesta inmune y las limitaciones inherentes de los enfoques serológicos y moleculares. La metodología incluyó la estandarización del ELISA-GS, el análisis de absorbancia, la identificación de concordancias y discordancias entre los métodos y la evaluación del impacto del rendimiento y la calidad de la proteína recombinante expresada, factores críticos para el rendimiento de los ensayos inmunodiagnósticos basados en antígenos recombinantes. Los resultados demostraron que la prueba comercial ELISA-Vetlisa/BIOCLIN (rK39) mostró una alta sensibilidad diagnóstica (100%) y una especificidad del 90,3%, lo que demuestra una alta capacidad para detectar anticuerpos en muestras clasificadas como positivas por PCR. La presencia de muestras seropositivas con PCR indetectable sugiere la persistencia de anticuerpos después de una exposición previa al parásito, variabilidad clínica entre animales infectados y limitaciones de la PCR cuando se aplica a muestras con baja carga parasitaria, especialmente en sangre periférica. El ensayo ELISA-GS mostró una sensibilidad del 83,3% y una especificidad del 100%, con dos falsos negativos y ningún falso positivo, lo que indica una alta capacidad para excluir animales no infectados, pero una menor eficiencia en la detección de todos los casos positivos en comparación con la prueba comercial. El análisis de la curva ROC mostró una mayor capacidad discriminatoria de la prueba comercial en comparación con el ensayo experimental. La glutamina sintetasa mostró un rendimiento moderado como objetivo para el diagnóstico serológico, posiblemente debido a su naturaleza predominantemente intracelular y a su limitada inmunogenicidad humoral detectable. Los resultados refuerzan la importancia de la interpretación integrada de los métodos serológicos y moleculares en el diagnóstico de la leishmaniasis visceral canina (LVC) y resaltan la relevancia del uso combinado de estrategias diagnósticas para aumentar la fiabilidad en la detección de la infección en perros de zonas endémicas.
dc.identifier.urihttps://dspace.unila.edu.br/handle/123456789/9907
dc.rightsopenAccess
dc.subjectleishmaniose visceral
dc.subjectsorodiagnóstico
dc.subjectglutamina sintetase
dc.subjectzoonose
dc.titleAnálise comparativa entre um teste sorológico comercial ELISA-VETLISA/BIOCLIN(RK39) e um ensaio baseado em glutamina sintetase para diagnóstico da leishmaniose visceral canina
dcterms.abstractCanine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonosis of great public health relevance, widely distributed in endemic areas, whose diagnosis is challenged by the diversity of clinical manifestations, the complexity of the immune response of infected dogs, and the limitations associated with available diagnostic methods. Accurate identification of infected animals is fundamental for clinical management and for disease surveillance and control strategies. This study performed a comparative analysis between two serological tests used in the diagnosis of CVL: the commercial ELISA-Vetlisa/BIOCLIN test (rK39) and an experimental assay based on the glutamine synthetase (GS) enzyme of Leishmania infantum. Serum samples from dogs from a partner laboratory were analyzed; these samples were obtained from animals undergoing diagnostic investigation for canine visceral leishmaniasis and accompanied by clinical information compatible with the disease, including weight loss, skin changes, lymphadenomegaly, and ophthalmological manifestations. In the adopted diagnostic workflow, samples were initially evaluated using the DPP® canine visceral leishmaniasis rapid immunochromatographic test (Bio-Manguinhos/Fiocruz) as a serological screening. Subsequently, samples were analyzed using the commercial ELISA-Vetlisa/BIOCLIN test (rK39) and the experimental ELISA-GS assay. Molecular detection by PCR was performed as the reference method for identifying parasitic DNA. The study evaluated the diagnostic performance of the methods through sensitivity, specificity, predictive values, and ROC curve analysis, considering the complexity of the immune response and the inherent limitations of serological and molecular approaches. The methodology included standardization of the ELISA-GS, absorbance analysis, identification of concordances and discordances between methods, and evaluation of the impact of yield and quality of the expressed recombinant protein, critical factors for the performance of immunodiagnostic assays based on recombinant antigens. The results demonstrated that the commercial ELISA-Vetlisa/BIOCLIN (rK39) test showed high diagnostic sensitivity (100%) and specificity of 90.3%, demonstrating a high capacity for detecting antibodies in samples classified as positive by PCR. The presence of seropositive samples with undetectable PCR suggests persistence of antibodies after previous exposure to the parasite, clinical variability among infected animals, and limitations of PCR when applied to samples with low parasite load, especially in peripheral blood. The ELISA-GS assay showed a sensitivity of 83.3% and specificity of 100%, with two false negatives and no false positives, indicating a high capacity for excluding uninfected animals, but lower efficiency in detecting all positive cases when compared to the commercial test. The ROC curve analysis showed a greater discriminatory capacity of the commercial test compared to the experimental assay. Glutamine synthetase showed moderate performance as a target for serological diagnosis, possibly due to its predominantly intracellular nature and limited detectable humoral immunogenicity. The results reinforce the importance of the integrated interpretation of serological and molecular methods in the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) and highlight the relevance of the combined use of diagnostic strategies to increase the reliability of detecting infection in dogs from endemic areas.

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