Desenho, construção e validação preliminar de um vetor autoinduzível para produção de proteínas

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dc.contributor.authorDorado, Jamily Brito
dc.date.accessioned2026-08-04T23:35:42Z
dc.date.available2026-08-04T23:35:42Z
dc.date.issued2026-08-04
dc.descriptionTrabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto Latino-Americano de Ciências da Vida e da Natureza da Universidade Federal da Integração Latino-Americana, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Biotecnologia.
dc.description.abstractO avanço na engenharia de bioprocessos e na tecnologia do DNA recombinante viabilizou a obtenção de proteínas heterólogas de alto valor terapêutico, diagnóstico e industrial. No entanto, os sistemas de expressão clássicos em Escherichia coli enfrentam limitações severas, como o custo elevado de indutores químicos (ex. IPTG e L-Arabinose), a sobrecarga metabólica celular e a toxicidade do produto. Diante deste cenário, este trabalho teve como objetivo geral projetar, construir e realizar a validação preliminar dos componentes essenciais de um vetor de expressão autoinduzível, denominado pSyn, utilizando o mecanismo de quorum sensing como ferramenta regulatória. Para isso, a metodologia envolveu a seleção e caracterização de partes biológicas padronizadas da via do operon lux de Vibrio fischeri para controlar a expressão da T7 RNA Polimerase e de promotores T7 modificados. Foram aplicadas técnicas clássicas de biologia molecular em cepas de E. coli BL21 e DH5α, incluindo extração de DNA genômico total, extração plasmidial por lise alcalina (miniprep), reações de amplificação por PCR, digestão enzimática com as enzimas de restrição SapI e PstI, e transformação bacteriana por choque térmico. As análises por espectrofotometria em Nanodrop e eletroforese em gel de agarose permitiram confirmar a obtenção e avaliar a qualidade das amostras de DNA plasmidial e genômico utilizadas como molde nos ensaios iniciais de amplificação. No entanto, a amplificação dos fragmentos-alvo correspondentes aos módulos I, II e III não foi plenamente bem-sucedida, indicando limitações associadas principalmente ao desenho dos primers, à possível presença de contaminantes nas preparações de DNA e à baixa concentração de alguns moldes. Esses resultados indicam a necessidade de redesenho dos primers e otimização das condições de PCR antes da montagem final do vetor pSyn. Apesar disso, o sistema demonstra-se promissor como uma alternativa biotecnológica sustentável, autônoma, escalonável e de baixo custo, perfeitamente alinhada às demandas industriais atuais de produção de biofármacos e insumos moleculares. Resumen El avance en la ingeniería de bioprocesos y la tecnología del ADN recombinante permitió obtener proteínas heterólogas de alto valor terapéutico, diagnóstico e industrial. Sin embargo, los sistemas de expresión clásicos en Escherichia coli enfrentan limitaciones severas, como el alto costo de los inductores químicos (por ejemplo, IPTG y L-arabinosa), la sobrecarga metabólica celular y la toxicidad del producto. Dado este escenario, este trabajo tuvo como objetivo diseñar, construir y realizar la validación preliminar de los componentes esenciales de un vector de expresión auto-inducible, llamado pSyn, utilizando el mecanismo de detección de quórum como herramienta regulatoria. Para ello, la metodología implicó la selección y caracterización de partes biológicas estandarizadas de la vía del operon lux de Vibrio fischeri para controlar la expresión de la T7 RNA polimerasa y los promotores modificados de T7. Se aplicaron técnicas clásicas de biología molecular en cepas de E. coli BL21 y DH5α, incluyendo extracción genómica total del ADN, extracción por lisis alcalina plasmidial (miniprep), reacciones de amplificación por PCR, digestión enzimática con las enzimas de restricción SapI y PstI, y transformación bacteriana por choque térmico. El análisis por espectrofotometría de NanoDrop y electroforesis en gel de agarosa permitió confirmar la obtención y evaluar la calidad de las muestras de ADN plasmidial y genómico utilizadas como plantilla en los ensayos iniciales de amplificación. Sin embargo, la amplificación de los fragmentos objetivo correspondientes a los módulos I, II y III no fue completamente exitosa, lo que indica limitaciones principalmente asociadas con el diseño de los primers, la posible presencia de contaminantes en las preparaciones de ADN y la baja concentración de algunos moldes. Estos resultados indican la necesidad de rediseñar los primers y optimizar las condiciones de PCR antes del ensamblaje final del vector pSyn. A pesar de esto, el sistema es prometedor como una alternativa biotecnológica sostenible, autónoma, escalable y de bajo costo, perfectamente alineada con las demandas industriales actuales para la producción de productos biofarmacéuticos e insumos moleculares.
dc.identifier.urihttps://dspace.unila.edu.br/handle/123456789/9964
dc.language.isovi
dc.rightsopenAccess
dc.subjectproteínas heterólogas
dc.subjectquorum sensing
dc.subjectbiologia molecular
dc.subjectvetor de expressão autoinduzível
dc.titleDesenho, construção e validação preliminar de um vetor autoinduzível para produção de proteínas
dcterms.abstractAdvances in bioprocess engineering and recombinant DNA technology have enabled the production of high therapeutic, diagnostic, and industrial value heterologous proteins. However, classical expression systems in Escherichia coli face severe limitations such as the high cost of chemical inducers (e.g., IPTG and L-Arabinose), cellular metabolic overload, and product toxicity. Given this scenario, this study aimed to design, build and carry out the preliminary validation of the essential components of a self-inducible expression vector, called pSyn, using the quorum sensing mechanism as a regulatory tool. For this, the methodology involved the selection and characterization of standardized biological parts of the Vibrio fischeri lux operon pathway to control the expression of T7 RNA polymerase and modified T7 promoters. Classical molecular biology techniques were applied in E. coli BL21 and DH5α strains, including total genomic DNA extraction, alkaline lysis plasmid DNA extraction (miniprep), amplification reactions by PCR, enzymatic digestion with restriction enzymes SapI and PstI, and bacterial heat-shock transformation. Nanodrop spectrophotometry and agarose gel electrophoresis runs confirmed the recovery and quality assessment of plasmid and genomic DNA samples used as templates for the initial amplification assays. However, the amplification of the target fragments corresponding to modules I, II and III was not fully successful, indicating limitations mainly associated with primer design, possible contaminants in the DNA preparations, and insufficient template concentration. These results indicate the need to redesign the primers and optimize the PCR conditions before proceeding to the final assembly of the pSyn vector. Despite this, the system proves promising as a sustainable, autonomous, scalable and low-cost biotechnology alternative, perfectly aligned with current industrial demands for production of biopharmaceuticals and molecular reagents.

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