Padronização da amplificação isotérmica mediada por Loop (LAMP) para detecção de Babesia Canis
Data
2023
Autores
Spinozzi Bicudo, Lia
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Resumo
Hemoparasitoses caninas, endêmicas no Brasil e emergentes globalmente, são de relevante preocupação na medicina veterinária devido à sua alta morbidade e mortalidade em cães. Transmitidas principalmente por carrapatos, especificamente Rhipicephalus sanguineus, essas doenças são potencialmente zoonóticas e podem manifestar-se em áreas urbanas e rurais. Dentre as principais hemoparasitoses no Brasil, pode-se citar a babesiose canina, causada pelo agente do gênero Babesia. Embora muitos cães manifestem sintomas clínicos evidentes, há casos de portadores assintomáticos. Assim, um obstáculo presente é a ausência de um método de diagnóstico ágil, preciso e econômico que permita o tratamento precoce apropriado para os cães, a fim de minimizar as complicações associadas. Portanto, é essencial criar uma técnica de detecção rápida, específica e de custo acessível para esse patógeno. Uma alternativa promissora é a técnica de Amplificação Isotérmica Mediada por Loop (LAMP), que apresenta uma combinação de eficiência, rapidez e custo mais baixo quando comparada à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) multiplicando o DNA desejado em uma temperatura estável e gerando diversas réplicas. O objetivo deste estudo foi desenvolver e padronizar a técnica LAMP para detectar o protozoário Babesia canis, causador da babesiose canina. Esta doença, comum em muitas regiões do mundo, é caracterizada principalmente pela destruição dos glóbulos vermelhos do hospedeiro, resultando em sintomas como febre, icterícia, anemia e, em alguns casos, manifestações neurológicas. Para isso, amostras de sangue, tecido e cultura provenientes de cães positivados sorologicamente para babesiose tiveram seu DNA extraído e foram realizados testes de padronização, utilizando dois pares de primers (F3, B3, FIP e BIP), variando os parâmetros temperatura, tempo e concentração do reagente betaína. Testaram-se quatro temperaturas (60 °C, 61 °C, 62 °C e 63 °C), sete períodos de incubação (60, 55, 50, 45, 40, 35 e 30 minutos) e sete diferentes concentrações de betaína (0M, 0.4M, 0.6M, 0.8M, 1.2M, 1.4M e 1.6M), utilizando água como controle negativo. A detecção visual do resultado da técnica foi realizada através do uso de 1uL do corante intercalante SYBR Green I por amostra. Os resultados indicaram que a reação foi padronizada de maneira simplificada, na qual o produto foi amplificado a 62°C, com um tempo de incubação de 60 minutos e 1.2M de betaína. O mesmo protocolo foi utilizado no teste de especificidade dos primers, no qual a técnica LAMP mostrou amplificação específica para Babesia canis, sem ocorrência de amplificação cruzada. Assim, o método LAMP revelou-se ágil e descomplicado, sendo excelente para identificar patógenos, como Babesia canis. Sugere-se estudos subsequentes para analisar a sensibilidade do exame.
Abstract
Descrição
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto Latino-Americano de Ciências da Vida e da Natureza da Universidade Federal da Integração Latino-Americana, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Biotecnologia.
Palavras-chave
métodos de detecção; LAMP; hemoparasitoses caninas; Babesia canis