Navegando por Autor "Dorado, Jamily Brito"

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    Desenho, construção e validação preliminar de um vetor autoinduzível para produção de proteínas
    (2026-08-04) Dorado, Jamily Brito
    O avanço na engenharia de bioprocessos e na tecnologia do DNA recombinante viabilizou a obtenção de proteínas heterólogas de alto valor terapêutico, diagnóstico e industrial. No entanto, os sistemas de expressão clássicos em Escherichia coli enfrentam limitações severas, como o custo elevado de indutores químicos (ex. IPTG e L-Arabinose), a sobrecarga metabólica celular e a toxicidade do produto. Diante deste cenário, este trabalho teve como objetivo geral projetar, construir e realizar a validação preliminar dos componentes essenciais de um vetor de expressão autoinduzível, denominado pSyn, utilizando o mecanismo de quorum sensing como ferramenta regulatória. Para isso, a metodologia envolveu a seleção e caracterização de partes biológicas padronizadas da via do operon lux de Vibrio fischeri para controlar a expressão da T7 RNA Polimerase e de promotores T7 modificados. Foram aplicadas técnicas clássicas de biologia molecular em cepas de E. coli BL21 e DH5α, incluindo extração de DNA genômico total, extração plasmidial por lise alcalina (miniprep), reações de amplificação por PCR, digestão enzimática com as enzimas de restrição SapI e PstI, e transformação bacteriana por choque térmico. As análises por espectrofotometria em Nanodrop e eletroforese em gel de agarose permitiram confirmar a obtenção e avaliar a qualidade das amostras de DNA plasmidial e genômico utilizadas como molde nos ensaios iniciais de amplificação. No entanto, a amplificação dos fragmentos-alvo correspondentes aos módulos I, II e III não foi plenamente bem-sucedida, indicando limitações associadas principalmente ao desenho dos primers, à possível presença de contaminantes nas preparações de DNA e à baixa concentração de alguns moldes. Esses resultados indicam a necessidade de redesenho dos primers e otimização das condições de PCR antes da montagem final do vetor pSyn. Apesar disso, o sistema demonstra-se promissor como uma alternativa biotecnológica sustentável, autônoma, escalonável e de baixo custo, perfeitamente alinhada às demandas industriais atuais de produção de biofármacos e insumos moleculares. Resumen El avance en la ingeniería de bioprocesos y la tecnología del ADN recombinante permitió obtener proteínas heterólogas de alto valor terapéutico, diagnóstico e industrial. Sin embargo, los sistemas de expresión clásicos en Escherichia coli enfrentan limitaciones severas, como el alto costo de los inductores químicos (por ejemplo, IPTG y L-arabinosa), la sobrecarga metabólica celular y la toxicidad del producto. Dado este escenario, este trabajo tuvo como objetivo diseñar, construir y realizar la validación preliminar de los componentes esenciales de un vector de expresión auto-inducible, llamado pSyn, utilizando el mecanismo de detección de quórum como herramienta regulatoria. Para ello, la metodología implicó la selección y caracterización de partes biológicas estandarizadas de la vía del operon lux de Vibrio fischeri para controlar la expresión de la T7 RNA polimerasa y los promotores modificados de T7. Se aplicaron técnicas clásicas de biología molecular en cepas de E. coli BL21 y DH5α, incluyendo extracción genómica total del ADN, extracción por lisis alcalina plasmidial (miniprep), reacciones de amplificación por PCR, digestión enzimática con las enzimas de restricción SapI y PstI, y transformación bacteriana por choque térmico. El análisis por espectrofotometría de NanoDrop y electroforesis en gel de agarosa permitió confirmar la obtención y evaluar la calidad de las muestras de ADN plasmidial y genómico utilizadas como plantilla en los ensayos iniciales de amplificación. Sin embargo, la amplificación de los fragmentos objetivo correspondientes a los módulos I, II y III no fue completamente exitosa, lo que indica limitaciones principalmente asociadas con el diseño de los primers, la posible presencia de contaminantes en las preparaciones de ADN y la baja concentración de algunos moldes. Estos resultados indican la necesidad de rediseñar los primers y optimizar las condiciones de PCR antes del ensamblaje final del vector pSyn. A pesar de esto, el sistema es prometedor como una alternativa biotecnológica sostenible, autónoma, escalable y de bajo costo, perfectamente alineada con las demandas industriales actuales para la producción de productos biofarmacéuticos e insumos moleculares.