Santos, Matheus Araujo dos2025-02-042025-02-042025https://dspace.unila.edu.br/handle/123456789/8798Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto Latino-Americano de Ciências da Vida e da Natureza da Universidade Federal da Integração Latino-Americana, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Biotecnologia.Os objetivos de desenvolvimento sustentável da ONU, em especial os objetivos 9 e 12 estimulam a adoção de tecnologias sustentáveis, consumo consciente e menor geração de resíduos. Nesse contexto, o estabelecimento de plataformas microbianas e uso de biomassa e resíduos energéticos subutilizados são estratégias promissoras para bioprodução de compostos bioprivilegiados que possam ser utilizados como drop-in na cadeia de refino do petróleo. Entre os diversos compostos que tem aplicação industrial e podem ser originados biologicamente, o ácido mucônico (AM) tem ganhado destaque, podendo ser convertido em polímeros comerciais de alto valor agregado, como ácido tereftálico e ácido adípico. Tradicionalmente, a produção industrial de AM provém de matérias-primas petroquímicas e seu processamento em outros derivados acarreta na geração de resíduos tóxicos e gases nocivos como óxido nitroso. Em Escherichia coli, uma via para a produção de ácido mucônico pode ser estabelecida a partir da expressão heteróloga de três enzimas, que utilizam como percursor um intermediário nativo da via do chiquimato, o 3-desidroshiquimato (3-DHS). Neste trabalho buscamos otimizar a produção de 3-DHS através da superexpressão dos genes aroB e aroD de diferentes organismos em três configurações (operon, pseudo-operon e monocistrônico). Além disso avaliamos glicose e glicerol como fonte de carbono a fim de encontrar a fonte mais adequada para produção de 3-DHS, e consequentemente de ácido mucônico. Por meio desta avaliação, observamos que a superexpressão dos genes aroB e aroD podem aumentar o acúmulo de 3-DHS em comparação a uma cepa sem superexpressão, quando cultivada usando glicerol como fonte de carbono, diferentemente do observado ao utilizar glicose. Com glicerol, a cepa controle, sem a superexpressão dos genes aroB e aroD, foi capaz de produzir 3,9 g/L de 3-DHS, enquanto que as cepas com a superexpressão destes genes produziram de 3,6 a 4,5 g/L. O cassette monocistrônico contendo os genes aroB de E. coli W e aroD de E. faecalis foi identificado como o mais eficiente na produção de 3-DHS, atingindo 4,5 g/L após 72 h de cultivo em placa de 96 poços, com rendimento de 0,24 g de 3-DHS por glicerol, e 91% do glicerol consumido. Resumen Los objetivos de desarrollo sostenible de la ONU, especialmente los objetivos 9 y 12, fomentan la adopción de tecnologías sostenibles, el consumo consciente y la menor generación de residuos. En este contexto, el establecimiento de plataformas microbianas y el uso de biomasa y residuos orgánicos subutilizados son estrategias prometedoras para la bioproducción de compuestos bioprivilegiados que pueden utilizarse como drop-in en la cadena de refinación del petróleo. Entre los diversos compuestos que tienen aplicación industrial y pueden tener origen biológica, el ácido mucónico (MA) ha ganado protagonismo y puede convertirse en polímeros comerciales de alto valor agregado, como el ácido tereftálico y el ácido adípico. Tradicionalmente, la producción industrial de AM proviene de materias primas petroquímicas y su procesamiento en otros derivados conduce a la generación de desechos tóxicos y gases nocivos como el óxido nitroso. En Escherichia coli, se puede establecer una vía para la producción del ácido mucónico mediante la expresión heteróloga de tres enzimas, que utilizan como precursor un intermedio nativo de la vía del chiquimato, el 3-desidrochiquimato (3-DHS). En este trabajo buscamos optimizar la producción del 3-DHS mediante la sobreexpresión de los genes aroB y aroD de diferentes organismos en tres configuraciones (operón, pseudooperón y monocistrónico). Además, evaluamos la glucosa y el glicerol como fuentes de carbono para encontrar la fuente más adecuada para la producción de 3-DHS, y en consecuencia, el ácido mucónico. Con esta evaluación, observamos que la sobreexpresión de los genes aroB y aroD pueden aumentar el acumulo de 3-DHS en comparación con una cepa sin sobreexpresión, cuando se cultiva utilizando glicerol como fuente de carbono, diferente de lo que se observa cuando se utiliza glucosa. En glicerol la cepa control, sin sobreexpresión de los genes aroB y aroD, fue capaz de producir 3,9 g/L de 3-DHS, mientras que las cepas con sobreexpresión de estos genes produjeron de 3,6 a 4,5 g/L. El cassette monocistrónico que contiene los genes aroB de E. coli W y aroD de E. faecalis fue identificado como el más eficiente en la producción de 3-DHS, alcanzando 4,5 g/L después de 72 h de cultivo en una placa de 96 pocillos. Con un rendimiento de 0,24 g de 3-DHS por glicerol, y 91% del glicerol consumido.viopenAccessgenesengenharia metabólica3-desidrochiquimatoresíduos